De su formación nada se sabe, aunque probablemente se produce en el campo de la miniatura y en contacto con el arte de Hugo Van der Goes. En 1496, aparece en España trabajando para Isabel la Católica, para quien pinta la mayor parte del Políptico de Isabel la Católica. En esta obra aparecen dos de los rasgos que definen su estilo: la utilización de tipos humanos y colores propios de la tradición flamenca y el empleo de escenarios arquitectónicos clasicistas por influencia del renacimiento. A la muerte de Isabel la Católica en 1504, Juan de Flandes permanece en Castilla, donde recibe encargos principalmente de clientes eclesiásticos. En estas obras introduce elementos nuevos que muestran la evolución de su arte en Castilla, tales como una mayor monumentalidad en sus figuras y unos escenarios naturales mucho más austeros. Su principal discípulo es Juan de Tejerina, aunque su influencia posterior es limitada debido a la inclinación que sentían los clientes por la vena más patética del arte flamenco, en contraposición a el estilo de Juan de Flandes, sereno y equilibrado.