Su fundación data de 1941, aunque no se inaugura hasta 1965. Supone la cristalización de una idea que se venía gestando desde tiempos del Cardenal Cisneros con distintas denominaciones: Museo Biblioteca de Ultramar, Museo Arqueológico de Indias… Los fondos, procedentes de las antiguas colecciones de arqueología y etnografía americana del Museo Arqueológico Nacional, estuvieron provisionalmente instalados en unas salas del citado museo, hasta que en 1962 se produjo el traslado a su sede actual.

El espacio de exposición se organiza en torno a cinco grandes áreas: El conocimiento de América, La realidad de América, La sociedad, La religión y La comunicación. En ellas se pretende abarcar toda la historia del continente americano, desde la Prehistoria hasta nuestros días, dando una atención preferente a las culturas precolombinas y al arte colonial. El programa de exposiciones temporales se complementa con cursos y conferencias, talleres y visitas guiadas.
Entre sus fondos destacan El Tesoro de los Quimbayas, los Encochados de la Conquista de Méjico y la más antiguas colecciones europeas de objetos pertenecientes a los indios de las Praderas.